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本试剂盒提供了一种经典而又快速简便的细胞凋亡检测方法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。所以Hoechst 33258染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。典型的Hoechst 33258染色后的细胞图片参考下图。

本试剂盒提供了固定液，染色液，及抗荧光淬灭封片液。对贴壁细胞，悬浮细胞和组织切片均适用。只需25分钟即可完成细胞凋亡检测的整个过程。

• 需可以观察蓝色荧光的荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
  
• 需PBS或0.9% NaCl溶液。
  
• 需自备盖玻片与载玻片。
  
• 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。
  
• 在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光。
  
• 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 贴壁细胞
  
  • 取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的PBS或0.9% NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%～80%满。
    
  • 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5mL固定液，固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。
    
  • 去固定液，用PBS或0.9% NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。
    
  • 加入0.5mL Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。
    
  • 去染色液，用PBS或0.9% NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。
    
  • 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。
    
  • 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右，发射波长460nm左右，图谱请参考下图。
• 悬浮细胞
  
  • 离心收集细胞样品于1.5mL离心管内，加入0.5mL固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。
    
  • 离心去固定液，用PBS或0.9% NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动数次。
    
  • 离心后吸去大部分液体保留约50μL液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。
    
  • 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
    
  • 均匀滴上0.5mL Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。
    
  • 去染色液，用PBS或0.9% NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。
    
  • 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。
    
  • 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右，发射波长460nm左右，图谱请参考下图。
• 组织切片
  
  • 常规包埋切片后，根据切片的不同类型，处理至可以用于免疫组化染色。
    
  • PBS或0.9% NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。可在六孔板中操作。
    
  • 加入0.5mL Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。
    
  • 去染色液，用PBS或0.9% NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。
    
  • 小心将切片置于载玻片上，滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。
    
  • 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右，发射波长460nm左右，图谱请参考下图。
    
    Hoechst 33258的吸收光谱和发射光谱，左侧峰为吸收光谱，右侧峰为发射光谱。